Avaliação do perfil de microRNAs exossomais em portadores de hipercolesterolemia familial / Evaluation of the profile of exosomal microRNAs in patients with familial hypercholesterolemia

A Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma doença hereditária do metabolismo lipídico que causa aos portadores alta incidência de aterosclerose prematura. A HF pode ser diagnosticada clínica e geneticamente, entretanto, apenas cerca de 40% podem ter confirmados pelo diagnostico molecular. Assim, outros sistemas de diagnóstico devem ser avaliados. Ultimamente devido a estabilidade em fluidos biológicos, os exossomos circulantes apresentam grande potencial, pois carreiam um número variado de compostos e são considerados veículos de intercomunicação entre os tecidos. Sabe-se que vários RNAs são carreados nos exossomos, incluindo miRNAs, lncRNA e uma variedade de proteínas. Estes componentes podem ser marcadores de diagnóstico para várias doenças inclusive a HF e suas complicações cardiovasculares. Foram utilizadas amostras de exossomos plasmáticos provenientes de 54 pacientes HF sem uso de estatina por, no mínimo, seis semanas, e 38 indivíduos normolipidêmicos para sequenciamento de miRNAs e estudo da proteômica. Os exossomos foram isolados utilizando dois métodos precipitação química e cromatográfica de exclusão de tamanho e caraterizados utilizando: dispersão de luz dinâmica, Western blotting, rastreamento de nanopartículas (NanoSight), imunomarcação e microscopia eletrônica de transmissão. Os miRNAs e proteínas foram extraídos dos exossomos e analisados por sequenciamento de nova geração e espectrometria de massa, respectivamente. Os dados clínicos, biodemográficos e laboratoriais dos pacientes HF e controles indicaram diferenças significativas esperadas entre os grupos, indicando que foram selecionados adequadamente. A caracterização físico-química dos exossomos mostrou resultados com tamanho de ˜90nm e imunorreação positiva para tetraspaninas. O resultado do sequenciamento identificou acima 2000 miRNAs. Os miR-122- 5p e miR-21-5p apresentaram expressão aumentada no grupo HF (log2FC=1,79 e log2FC=1,27, respectivamente), e o miR-122-5p pós normalização em relação ao controle manteve significativo comparados ao controle (p=0,034). A análise comparativa entre exossomos e plasma total mostrou diferença significativa, pois foram identificadas 239 proteínas (p <0,05) diferentes entre exossomos e plasma. Em exossomos, 17 proteínas foram aumentadas e 21 diminuídas em pacientes com HF em comparação com o controle (p <0,05). Destas, seis proteínas foram mais abundantes em HF e sete proteínas foram menos abundantes em exossomos de pacientes com HF em comparação com o controle. A análise de enriquecimento por bioinformática mostrou que a maior parte dessas moléculas (miRNAs e proteínas) foram relacionadas com metabolismo lipídico, dislipidemia, aterosclerose, doença arterial coronariana, adipogênese. Assim, na busca de novos alvos como potenciais biomarcadores de diagnóstico da HF, nossos resultados da análise integrativa entre os miRNAs e as proteínas exossomais abre novas frentes de pesquisa mais bem direcionadas, para a validação desses miRNAs e proteínas exossomais

Familial Hypercholesterolemia (FH) is an inherited disease of lipid metabolism that causes a high incidence of premature atherosclerosis in patients. FH can be diagnosed clinically and genetically, however, only about 40% can be confirmed by molecular diagnosis. Thus, other diagnostic systems should be evaluated. Lately, due to stability in biological fluids, circulating exosomes have great potential, as they carry a varied number of compounds and are considered vehicles of intercommunication between tissues. Several RNAs are known to be carried on exosomes, including miRNAs, lncRNA, and a variety of proteins. These components can be diagnostic markers for several diseases including FH and its cardiovascular complications. Plasma exosome samples from 54 FH patients without statin use for at least six weeks and 38 normolipidemic individuals were used for miRNA sequencing and proteomics studies. Exosomes were isolated using two methods chemical precipitation and size exclusion chromatography and characterized using: dynamic light scattering, Western blotting, nanoparticle tracking (NanoSight), immunostaining and transmission electron microscopy. MiRNAs and proteins were extracted from exosomes and analyzed by next-generation sequencing and mass spectrometry, respectively. Clinical, biodemographic and laboratory data of FH patients and controls indicated significant expected differences between the groups, indicating that they were appropriately selected. The physicochemical characterization of exosomes showed results with a size of ˜90nm and positive immunoreaction for tetraspanins. The sequencing result identified above 2000 miRNAs. miR-122-5p and miR-21-5p showed increased expression in the FH group (log2FC=1.79 and log2FC=1.27, respectively), and miR122-5p after normalization in relation to the control remained significant compared to the control (p=0.034). The comparative analysis between exosomes and total plasma showed a significant difference, as 239 different proteins (p < 0.05) were identified between exosome and plasma. In exosomes, 17 proteins were increased and 21 decreased in FH patients compared to control (p < 0.05). Of these, six proteins were more abundant in FH and seven proteins were less abundant in exosomes from patients with FH compared to the control. Bioinformatics enrichment analysis showed that most of these molecules (miRNAs and proteins) were related to lipid metabolism, dyslipidemia, atherosclerosis, coronary artery disease, adipogenesis. Thus, in the search for new targets as potential diagnostic biomarkers of FH, our results of the integrative analysis between miRNAs and exosomal proteins opens new and better-directed research fronts for the validation of these miRNAs and exosomal proteins

Avaliação do perfil de metilação dos genes LDLR, PCSK9, LDLRAP1 em pacientes portadores de hipercolesterolemia familial / Evaluation of the methylation profile of LDLR, PCSK9, LDLRAP1 genes in patients with familial hypercholesterolemia

As variabilidades genotípicas que determinam algumas alterações fenotípicas e metabólicas podem ter seu diagnostico falho se baseado apenas nos dados genômicos. Na hipercolesterolemia familial (HF) pode-se observar que os dados de variantes nos genes da LDLR, PCSK9, APOB e LDLRAP1 sugeridos pelos consensos atuais para confirmar o diagnóstico, tem mostrado serem insuficientes, mostrando baixa porcentagem de confirmação, mesmo nos dos casos em que características fenotípicas apresentam dados sugestivos importantes. A complementação no auxílio diagnóstico com dados epigenéticos tem sido sugerida em muitas doenças, principalmente nas crônicos degenerativos. A metilação do DNA pode estar envolvida no mecanismo que regulam vários processos metabólicos, entre os quais os envolvidos na expressão de proteínas e neste estudo os que estão envolvidos no metabolismo do colesterol, que poderia explicar fenótipos hipercolesterolemicos sem demonstração clara de variantes nos genes de consenso. O objetivo do presente estudo foi comparar o perfil de metilação dos genes LDLR, PCSK9 e LDLRAP1 entre pacientes com diagnóstico de Hipercolesterolemia Familial confirmado através de variantes genéticas descritas na literatura e pacientes sem diagnóstico confirmado. Além da comparação com indíviduos normolipidêmicos. A seleção dos indivíduos foi realizada na Seção de Dislipidemia do Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia (IDPC), do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP). Através dos critérios MEDPED foram selecionados 133 pacientes para a realização do sequenciamento de um painel de genes relacionados ao fenótipo de HF e a homeostasia do colesterol a fim de confirmar o diagnóstico. Todos os pacientes tiveram o DNA purificado, que foi submetido ao tratamento com bissulfito, amplificado, purificado, desnaturado e sequenciado no sistema PyroMark Q24. Avaliou-se o perfil de metilação, em sítio CpG dos genes da LDLR, PCSK9 e LDLR AP1. A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS v.19, GraphPad Prism, versão 1.03 e o e o software R. 4.1.0. Os pacientes foram classificados em Grupo I: Pacientes com diagnóstico molecular confirmado pelo estudo fenotípico e genotipico (n=40); Grupo II: Pacientes fenotipicamente determinados como hipercolesterolemico, mas sem diagnóstico molecular confirmado pelo estudo genomico (n=93); Grupo III: indivíduos fenotipicamente determinados normolipidêmicos de acordo com a V Diretriz Brasileira de Dislipidemia (n=23). A análise comparativa entre os grupos I x II e II x III, demonstrou diferença estatísta significativa em 13 sítios CpG do total de 28 sítios CpG analisados nos três genes. Além disso, foi possível concluir que alterações nos sítios CpG presentes no gene LDLR influenciaram na presença de xantomas e arco córneo. Houve correlação positiva entre a idade e perfil de metilação do gene PCSK9, assim como, alterações nos sítios CpG deste gene influenciaram na presença de arco córneo e IAM. Além disso, alterações no sítio CPG presente no gene LDLRAP1 influenciou no desenvolvimento de DAC, IAM e RM, além da presença de xantelasma

The genotypic variabilities that determine some phenotypic and metabolic alterations can be misdiagnosed if based only on genomic data. In familial hypercholesterolemia (FH) it can be observed that the data of variants in the genes of LDLR, PCSK9, APOB and LDLR AP1 suggested by the current consensus to confirm the diagnosis, has shown to be insufficient, showing a low percentage of confirmation, even in the cases in which phenotypic characteristics present important suggestive data. Complementing the diagnostic aid with epigenetic data has been suggested in many diseases, especially in chronic degenerative diseases. DNA methylation may be involved in the mechanisms that regulate several metabolic processes, including those involved in the expression of proteins that ,in this study, are involved in cholesterol metabolism, which could explain hypercholesterolemic phenotypes without a clear demonstration of variants in consensus genes. The aim of the present study was to compare the methylation profile of LDLR, PCSK9 and LDLRAP1 genes between patients with a diagnosis of Familial Hypercholesterolemia confirmed through genetic variants described in the literature and patients without a confirmed diagnosis. In addition to the comparison with normolipidemic individuals. The selection of individuals was carried out at the Dyslipidemia Section of the Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia (IDPC), in the Department of Clinical and Toxicological Analyzes of the Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN), in the State University of Campinas (UNICAMP) and in the Faculdade of Medicine of São José do Rio Preto (FAMERP). Through the MEDPED criteria, 133 patients were selected to perform the sequencing of a panel of genes related to the FH phenotype and cholesterol homeostasis in order to confirm the diagnosis. All patients had their DNA purified, which were subjected to bisulfite treatment, amplified, purified, denatured and sequenced on the PyroMark Q24 system. The methylation profile in the CpG site of the LDLR, PCSK9 and LDLRAP1 genes were evaluated. Statistical analysis were performed using SPSS v.19 software, GraphPad Prism, version 1.03 and R. 4.1.0 software. Patients were classified into Group I: Patients with a molecular diagnosis confirmed by phenotypic and genotypic studies (n=40); Group II: Patients phenotypically determined to be hypercholesterolemic, but without a molecular diagnosis confirmed by the genomic study (n=93); Group III: phenotypically determined normolipidemic individuals according to the V Brazilian Dyslipidemia Directive (n=23). The comparative analysis between groups I x II and II x III showed a statistically significant difference in 13 CpG sites of the total of 28 CpG sites analyzed in the three genes of the project. Furthermore, it was possible to conclude that alterations in the CpG sites present in the LDLR gene influenced the presence of xanthomas and arc corneum. There was a positive correlation between age and PCSK9 gene methylation profile, as well as changes in the CpG sites of this gene influenced the presence of arc corneum and AMI. In addition, alterations in the site present in the LDLRAP1 gene are influencing the development of CAD, AMI and MR, in addition to the presence of xanthelasma

Caracterização funcional in vitro de variantes no gene PCSK9 identificadas em pacientes com Hipercolesterolemia Familial / In vitro functional characterization of PCSK9 variants identified in patients with Familial Hypercholesterolemia

A Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma doença genética do metabolismo das lipoproteínas, caracterizada pelo aumento do colesterol plasmático, transportado principalmente pela lipoproteína de baixa densidade (LDL). A HF é causada principalmente por mutações nos genes LDLR, APOB e PCSK9. As mutações conhecidas na PCSK9 podem levar ao aumento ou diminuição da função proteolítica da proteína, as quais são associadas ao aumento ou diminuição da LDL-c plasmática, respectivamente. Com o projeto genoma humano surgiram novos métodos de sequenciamento, o que resultou em um grande número de novas variantes genéticas relacionadas à HF. Entretanto, os mecanismos pelos quais essas variantes influenciam na concentração do colesterol e sua interferência na resposta terapêutica não estão totalmente elucidados. O objetivo do presente trabalho foi avaliar in vitro o efeito de variantes na região codificadora e reguladora do gene PCSK9 identificadas em pacientes HF utilizando sequenciamento de nova geração. Para a caracterização funcional das variantes na região codificadora da PCSK9, primeiramente foi avaliado o impacto dessas variantes na interação PCSK9-LDLR via Docking molecular. Células HEK293FT foram transfectadas com as diferentes construções da PCSK9, e posteriormente, foram utilizadas em ensaios para avaliar a atividade do LDLR e a internalização de LDL por citometria de fluxo. Para as variantes na região reguladora da PCSK9, foi realizado uma predição in silico do possível efeito de variantes na região 3UTR na ligação de miRNAs. A avalição da interação entre os miRNAs preditos, e a região 3UTR da PCSK9, e o possível impacto nessa interação na presença de variantes na região 3UTR, foi realizada em células HEK293FT transfectadas com um plasmídeo contendo a 3UTR da PCSK9 e um gene repórter da Gaussia luciferase, juntamente com um plasmídeo de expressão contendo os miRNAs de interesse. Foi também estudado o efeito dos miRNAs preditos sobre a expressão, RNAm e proteína, da PCSK9 via RT-qPCR e Western blot, em células HepG2. Foram identificadas 9 variantes na região codificadora da PCSK9, e duas, E32K e R469W, foram selecionadas para os ensaios posteriores. Para a R469W foi observada uma possível alteração conformacional a qual poderia aumentar a afinidade da PCSK9 pelo LDLR. Para a E32K, uma possível associação com HF foi observada em uma família brasileira com ascendência japonesa. As variantes E32K e R469W apresentaram uma redução na atividade do LDLR de 5 e 11%, respectivamente em comparação a PCSK9-WT. Entretanto, não foram observadas reduções estaticamente significativas na atividade do LDLR e na internalização da LDL em células transfectadas com ambas as variantes. Dez variantes foram encontradas na região 3UTR da PCSK9, entre elas três foram selecionadas por impactar a ligação de quatro miRNAs. Nossos dados demonstraram uma redução significativa na expressão da PCSK9 em células HepG2 transfectadas com os miR-4721 e miR-564 (p=0,036 e p=0,010, respectivamente). Porém, não foi observada diferenças na expressão da luciferase em células transfectadas com esses miRNAs, não sendo possível validar a interação miRNA-RNAm. As variantes no gene PCSK9 identificadas no nosso estudo podem não explicar individualmente o fenótipo HF, mas podem contribuir para a severidade da doença juntamente com outras variantes em outros genes

Familial Hypercholesterolemia (FH) is a genetic disorder of lipoprotein metabolism, characterized by elevated plasma cholesterol levels, mostly carried by low-density lipoprotein (LDL). FH is mainly caused by mutations in three genes, LDLR, APOB, and PCSK9. Gain-of-function mutations in PCSK9 reduce LDL receptor levels, resulting in high levels of LDL cholesterol in the plasma. Loss-of-function mutations lead to higher levels of the LDL receptor, resulting in lower LDL cholesterol levels. The Human Genome Project led to a faster technological development related to sequencing methods, which allowed identifying many novel variants associated with FH. However, the mechanisms by which these variants influence cholesterol levels and their interference in therapeutic response are not fully understood. The aim of the present study was to perform an in vitro characterization of the effect of PCSK9 variants identified in FH patients using Next-Generation Sequencing. For the functional characterization of variants in the coding region of PCSK9, the impact of these variants on PCSK9-LDLR interaction was evaluated by molecular docking. HEK293FT cells were transiently transfected with different PCSK9 constructs, and the amount of cell surface LDLR and LDL internalization were determined by flow cytometry. For the variants in PCSK9 3UTR region, an in silico prediction of PCSK9 3UTR variants in miRNA seed regions and target sites was performed. To determine whether the predicted miRNAs directly interact with PCSK9 3UTR region, HEK293FT cells were co-transfected with a vector containing a PCSK9 3'UTR region and a Gaussia luciferase reporter gene, together with an expression plasmid containing the miRNAs of interest. The effect of the predicted miRNAs on the expression of PCSK9 was evaluated using RT-qPCR and Western blot in HepG2 cells transiently transfected with miRNA mimics. Nine missense variants were identified in PCSK9 gene. E32K e R469W were chosen for further analysis. For R469W, a possible conformational change was observed that could increase the affinity of PCSK9 for LDLR, when compared to the wild-type. For E32K, a possible association with FH in a Brazilian family with Japanese ancestry was observed. E32K and R469W had a 5% and 11% decreased level of cell surface LDLR, respectively, as compared with WT-PCSK9. However, no significant reduction in the number of cell surface LDLR and LDL internalization was observed in transfected cells for both variants. Ten variants were found in PCSK9 3'UTR region, of which three were selected for affecting the binding of four miRNAs. Our data demonstrated a significant downregulation of PCSK9 in cells transfected with miR-4721 and miR-564 miRNA mimics, compared to cells transfected with a scramble control (p=0,036 and p=0,010, respectively). However, no differences in luciferase expression were observed in cells transfected with these miRNAs, therefore, it was not possible to experimentally validate miRNA-mRNA interaction. PCSK9 variants found in our study may not fully explain FH phenotype but may contribute to the severity of the disease together with other variants in other genes

Ultrassequenciamento exômico dos principais genes relacionados com a hipercolesterolemia familial / Ultrasequensing exomic of the main genes related to familial hypercholesterolemia

A frequência de Hipercolesterolemia Familial (HF) ainda é desconhecida no Brasil, principalmente pela ausência de estudos com caracterização genotípica associada à fenotípica. Os dados epidemiológicos existentes se baseiam apenas no fenótipos e carecem do diagnóstico molecular confirmatório. O objetivo do presente estudo foi identificar as principais causas genéticas da HF em pacientes diagnosticados fenotipicamente através de um painel exômico com 61 genes a fim de contribuir para um sistema de confirmação do diagnostico molecular em uma amostra da população brasileira. Para isso foram incluídos 141 pacientes, não aparentados, portadores de HF atendidos pelo setor de dislipidemias do Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia, Laboratório de Analises Clinicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e do Programa Hipercol Brasil do Instituto do Coração. As amostras de sangue periférico foram obtidas para determinações fenotípicas laboratoriais e extração de DNA genômico. A biblioteca de DNA foi construída utilizando o kit Nextera® Rapid Capture Enrichment Custom enriquecendo os éxons de 61 genes que direta ou indiretamente estão relacionados com metabolismo do colesterol. O ultrassequenciamento foi realizado utilizando kit MiSeq Reagent (300 a 500 ciclos) na plataforma MiSeq (Illumina). Os resultados de sequenciamento foram inicialmente alinhados a uma sequência referência e analisados para eliminação de falsos positivos, segundo os parâmetros de qualidade, tais como: cobertura mínima de 30x, frequência do alelo alterado maior que 20% e diferença da distribuição das leituras entre as sequências nucleotídicas menor que 15%. Foram identificadas 472 diferentes variantes em 56 dos genes presentes no painel, sendo 45 consideradas como não descritas. Nos genes APOA1, APOA2, LIPC, RBP4 e TIMP1 não foram observadas variantes dentro dos critérios estabelecidos. Das variantes observadas 25 identificadas em 30 (21,2%) pacientes já tinha sido publicadas em relação à HF nos três principais genes (LDLR, APOB e PCSK9), confirmando o diagnóstico. Foi caracterizado genotipicamente outras dislipidemias primárias em 7 pacientes, sem diagnóstico molecular de HF, através de variantes identificadas no ultrassequenciamento em outros genes. Dos 104 pacientes que não possuíam nenhuma variante já previamente caracterizada, 69 possuíam variantes relacionados com o metabolismo do colesterol. As variantes sem patogenicidade conhecida foram avaliadas através de ferramentas de predição in silico e 22 delas possuíam características sugestivas de patogenicidade em pelo menos 4 das ferramentas utilizadas, duas delas também mostraram alterar a estrutura da proteína segundo análises de docking molecular. Foram identificadas também 223 variantes em região não transcritas (UTR). Quando realizada as análises estatística de todas as variantes identificadas, observamos associação de 13 variantes com concentrações mais elevadas de colesterol da LDL, 5 com concentrações mais elevadas de apolipoproteina B-100, 5 com concentrações mais elevadas de colesterol total, 6 com presença de arco córneo, 2 com manifestação de xantelasmas, 2 com ausência de xantomas e 3 com a presença de doença arterial coronariana. Dessas 6 variantes já haviam sido previamente descritas com HF ou algum outro fenótipo associado e 2 não tinham citação na literatura pesquisada, mas possuíam característica patogênica para a proteína segundo as ferramentas de predição in silico. Este estudo permitiu a identificação das causas genéticas da HF em pacientes brasileiros diagnosticados fenotipicamente, mostrando que a técnica escolhida permitiu caracterizar 21,2% dos pacientes. Além disso, foi possível identificar outras dislipidemias primárias e caracterizar algumas variantes que, apesar de necessitarem serem validadas, indicam uma possível associação com a HF, aumentando o esclarecimento do fenótipo com o genótipo para 74,5%. Este estudo também possibilitou a identificação de novas variantes que devem ser avaliadas para confirmar associação com a doença e utilizar para o diagnóstico propondo um novo painel poligênico

The frequency of Familial Hypercholesterolemia (FH) is still unknown in Brazil, mainly due to the absence of studies with genotypic characterization associated with phenotype. Existing epidemiological data are based only on the phenotypes and lack the confirmatory molecular diagnosis. The aim of the present study was to identify main genetic causes of FH in patients diagnosed phenotypically through an exomic panel with 61 genes in order to contribute to a system of confirmation molecular diagnosis in a sample of the Brazilian population. To this end, 141 non-related patients with FH treated by the dyslipidemia sector of the Institute Dante Pazzanese of Cardiology, Clinical Analysis Laboratory of the Faculty of Pharmaceutical Sciences of the University Federal of Rio Grande do Norte and the Hipercol Brazil Program of the Heart Institute. Peripheral blood samples were obtained for laboratory phenotypic determinations and extraction of genomic DNA. The DNA library was constructed using the Nextera® Rapid Capture Enrichment Custom kit, enriching with éxons of 61 genes that are directly or indirectly related to cholesterol metabolism. Ultrasequencing was performed using MiSeq Reagent kit (300 to 500 cycles) on the MiSeq platform (Illumina). The sequencing results were initially aligned to a reference sequence and analyzed for false positive elimination according to quality parameters such as: minimum coverage of 30x, altered allele frequency greater than 20%, and difference in the distribution of reads between sequences nucleotides less than 15%. 472 different variants were identified in 56 of the genes present in the panel, of which 45 were considered not described. In the APOA1, APOA2, LIPC, RBP4 and TIMP1 genes no variants were observed within the established criteria. In 25 of the variants observed presents in 30 (21.2%) patients had already been published in relation to FH in the three main genes (LDLR, APOB and PCSK9), confirming the diagnosis. Other primary dyslipidemias were caracterized genotypically in 7 patients, without molecular diagnosis of HF, through variants identified in ultrasequencing in other genes. Of the 104 patients who did not have any previously characterized variant, 69 had variants related to cholesterol metabolism. The variants without known pathogenicity were evaluated using in silico prediction tools and 22 of them had characteristics suggestive of pathogenicity at least 4 of the tools used, two of them also showed to alter the structure of the protein according to molecular docking analyzes. Were also identified 223 non-transcribed region (UTR) variants. Statistical analysis of all the variants identified showed association of 13 variants with higher concentrations of LDL cholesterol, 5 with higher concentrations of apolipoprotein B-100, 5 with higher concentrations of total cholesterol, 6 with presence of an arc corneal, 2 with manifestation of xanthelasms, 2 with absence of xanthomas and 3 with the presence of coronary artery disease. Of these 6 variants had previously been described with HF or some other associated phenotype and 2 had no citation in the researched literature, but had a pathogenic characteristic for the protein according to in silico prediction tools. This study allowed the identification of the genetic causes of FH in Brazilian patients diagnosed phenotypically, showing that the technique chosen allowed to characterize 21.2% of the patients. In addition, it was possible to identify other primary dyslipidemias and to characterize some variants that, although they need to be validated, indicate a possible association with HF, increasing the clarification of the phenotype with the genotype to 74.5%. This study also allowed the identification of new variants that should be evaluated to confirm association with the disease and to use for the diagnosis proposing a new polygenic panel

Estudos da atividade do receptor da LDL em pacientes com Hipercolesterolemia Familial / Studies of LDL receptor activity in patients with familial hypercholesterolemia

A hipercolesterolemia familial (HF) é uma doença autossômica dominante considerada como uma das formas mais graves de hiperlipidemia, assim como, a principal causa de morbi-mortalidade por ser o principal fator desencadeante da aterosclerose. A alteração primária e mais freqüente da HF incide no gene do receptor da LDL (LDLr), sabe-se que mais de 1600 mutações são descritas na literatura e a principal consequência dessas alterações resultam no comprometimento da remoção da LDL, aumentando a concentração plasmática. Atualmente, o ultrasequenciamento genômico permite gerar muitos dados, que podem identificar novas mutações gênicas de forma eficiente, reprodutiva e rápida. No entanto, somente a validação da nova mutação por atividade funcional pode realmente estabelecer a associação com a doença. O presente estudo tem como objetivo realizar a análise da atividade do receptor da LDL, identificadas através do sequenciamento de alto rendimento, no gene LDLr realizado pelo nosso grupo de pesquisa e correlacionar com dados clínicos, in vitro, in silico e estrutural. Para cumprir esta meta, os linfócitos T dos portadores de HF foram isolados do sangue periférico, cultivados e submetidos a estímulo para a expressão de receptores da LDL, incubados com LDL marcada para avaliação de ligação e interiorização pelas células de cada paciente. Dos 30 pacientes selecionados para esse estudo, 63% apresentaram mutação no LDLR, sendo que quase todas as variantes (p.Gly373Asp, p.Asp601His, p.Ile488Thr, p.Gly549Asp, p.Gly592Glu e Gly681Asp) são localizadas no segundo domínio entre os éxons 7 ao 14. De acordo com o docking molecular a variante p.Gly592Glu (rs137929307), que já foi identificada na população polonesa, espanhola e brasileira, já relacionada com a HF, pode aumentar a interação do LDLr com a ApoB e consequentemente o modo de interação entre as proteínas, no estudo in vitro foi possível notar um aumento tanto na média de fluorescência da ligação e da ligação e interiorização em relação a quantidade de LDLr na superfície celular

Familial hypercholesterolemia (HF) is an autosomal dominant disease considered as one of the most severe forms of hyperlipidemia, as well as the main cause of morbidity and mortality because it is the main triggering factor for atherosclerosis. The primary and more frequent alteration of the HF affects the LDL receptor gene (LDLr), it is known that more than 1600 mutations are described in the literature and the main consequence of these alterations results in the compromise of the LDL removal, increasing the plasma concentration. Nowadays, genomic ultrasequencing allows the generation of many data, which can identify new gene mutations efficiently, reproductively and rapidly. However, only the validation of the new functional activity mutation can actually establish association with the disease. The aim of the present study was to analyze LDL receptor activity, identified by high-throughput sequencing, in the LDLr gene performed by our research group and to correlate with clinical, in vitro, in silico and structural data. To meet this goal, the T lymphocytes from the HF carriers were isolated from the peripheral blood, cultured and challenged for the expression of LDL receptors, incubated with labeled LDL for binding assessment and internalization by the cells of each patient. Of the 30 patients selected for this study, 63% had a mutation in LDLR, and almost all variants (p.Gly373Asp, p.Asp601His, p.Ile488Thr, p.Gly549Asp, p.Gly592Glu and Gly681Asp) are located in the second domain between exons 7 to 14. According to the molecular docking the variant p.Gly592Glu (rs137929307), which has already been identified in the Polish, Spanish and Brazilian population, already related to HF, can increase the interaction of LDLr with ApoB and consequently the mode of interaction between proteins, in the in vitro study it was possible to note an increase in both the mean fluorescence of binding and binding and internalization in relation to the amount of LDLr on the cell surface